蜜蜂球囊菌遗传转化体系构建及其致病性的分子机理研究

【摘要】蜜蜂是世界上最重要的经济昆虫,在世界上只要有花和花粉的地方就有蜜蜂。然而在生态上如此重要的昆虫却遭受着各种各样疾病的侵染,这些疾病可能由多种病原物引起,如真菌就是其中一种重要的病原微生物。对真菌病害的致病性机理的研究一直以来都是研究的热点。蜜蜂白垩病是由蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis)引起的,主要侵染蜜蜂的幼虫。研究表明,白垩病可致使蜜蜂蜂蜜产量减产5%-37%,使蜜蜂幼虫产生80%的死亡率。近些年来,由于蜜蜂白垩病发病较重,人们对杀菌剂使用较乱,导致蜂产品污染严重。再加上蜜蜂的转地饲养,蜜蜂长距离的运输又导致了蜜蜂白垩病的传播具有全球性。更为严重的是,引起蜜蜂白垩病的致病菌球囊菌的分生孢子可以在蜂蜜、花粉、蜂机具及发病蜂场的土壤中存活15年以上,当条件适宜其生长时,分生孢子会从环境中萌发出来,再次传播,使得该病很难根除。尽管科研人员提出了许多防控蜜蜂白垩病的技术措施,然而至目前为止,对蜜蜂白垩病的防治还是非常困难的。鉴于此,本研究采用分子生物学方法,利用限制性内切酶介导的基因整合技术构建了蜜蜂球囊菌遗传转化体系,获得了球囊菌致病性降低突变体,对蜜蜂球囊菌致病的分子机理进行了初步的探讨。1.蜜蜂球囊菌原生质体制备及其再生构建蜜蜂球囊菌REMI转化体系首先要制备出产量高再生率高的原生质体。本实验对影响蜜蜂球囊菌菌株原生质体制备及再生的因子进行了系统的研究,同时对蜜蜂球囊菌原生质体的释放及再生过程进行了显微观察。结果表明,采用液体培养基进行24hrs培养的蜜蜂球囊菌菌体,在28℃条件下,应用50mg/mL的崩溃酶,经4hrs酶解所制备的原生质体释放量最大,达到98.36×105/mL。在上述条件下,采用0.8mol/L柠檬酸与NaCl的混合液作为稳渗剂,原生质体的再生率也较高,达到51.06%。蜜蜂球囊菌以菌丝断裂方式释放原生质体,原生质体再生时表现为原生质体先是突出,其后延长,并最终发育成为正常菌丝。2.REMI转化子的获得及其验证采用REMI方法获得了11个转化子。经过PCR.ClustalW多序列比对及Southernblot方法验证,所获得突变体含有目的基因的插入,由此证明上述转化子为蜜蜂球囊菌突变菌株。3.蜜蜂球囊菌REMI突变子致病性鉴定通过幼虫接种实验,对所获得的REMI突变菌株进行了致病力进行了检测。结果表明,所获得的突变体菌株同原始菌株比较,致病力差异显著(p<0.01),接种后的第5天野生型菌株引起幼虫发病率达19.9%,病情指数达33.5,M4和M8的致病性明显小于野生型菌株,幼虫发病率仅为16.8%和14.3%,病情指数为28.9和23.7。同时,突变体菌株在侵染蜜蜂幼虫后,蜜蜂发病过程及幼虫死亡率均较野生型有较大差异。
【作者】AbebeJenberieWubie；
【导师】周婷；
【作者基本信息】中国农业科学院，特种经济动物饲养，2014，博士
【关键词】蜜蜂；球囊菌；原生质体；遗传转化；致病力；

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